Определение расширенного профиля сенсибилизации IgE на основе технологии макроматрицы: новый метод диагностики аллергии для персонифицированной медицины

Резюме

Общая информация. Персонифицированная медицина (ПМ) меняет сферу диагностики и лечения аллергии. В 60-х годах был разработан анализ IgE in vitro, метод прототипа ПМ, который вызвал все больший интерес из-за введения рекомбинантных компонентов в тест. Совсем недавно микрочипы с компонентами аллергена значительно улучшили способность описывать профиль IgE. Целью этого исследования было оценить характеристики недавно разработанного Allergy Explorer (ALEX), макроматрицы, которая содержит как экстрагированные «цельные» аллергены, так и молекулярные компоненты. Этот метод позволяет получить профиль IgE, который включает 282 компонента (157 экстрактов аллергенов и 125 компонентов), что приводит к широчайшему скринингу потенциальных аллергенов.

Методы: сыворотки от 43 пациентов с аллергией анализировали с помощью ALEX, а затем – с помощью ImmunoCAP ISAC. Результаты двух тестов сравнивались, была также оценена концентрация молекулярных компонентов с присутствием IgE в соответствующем экстракте.

Результаты: Наблюдалась хорошая корреляция между ISAC и ALEX. Результаты ALEX для тестов второго уровня (то есть специфического IgE для завершения экстрагированных аллергенов) согласуются с результатами, полученными для соответствующих компонентов.

Обсуждение. Несмотря на различия в методологии, профили IgE, обнаруженные для молекулярных аллергенов ALEX и ISAC, были очень похожи. Различия были, в основном, связаны с более низким динамическим диапазоном ALEX и с использованием ингибитора CCD в первой фазе инкубации, что уменьшало связывание IgE с CCD, как представлено в экстрагированных аллергенах и компонентах.

Вывод. Основываясь на наших выводах, ALEX представляет собой новый инструмент для описания профиля IgE в ПМ, где анализ IgE может выполняться на множественные аллергены и компоненты. В частности, полисенсибилизированные пациенты и пациенты с синдромом пыльца-еда будут иметь реальное преимущество благодаря сочетанию второго и третьего уровней диагностики аллергии в одном чипе.

Актуальность

Персонифицированная медицина (ПМ) оказывает значительное влияние на многие гуманитарные науки и оказывает особое влияние на диагностику и лечение аллергических заболеваний. Действительно, поскольку их происхождение, диагностика in vivo и in vitro способствовала точному и индивидуальному подходу к пациенту, в результате чего появился своего рода прототип ПМ. Специфический IgE-анализ был разработан в шестидесятые годы, но в начале девяностых число молекулярных аллергенов, клонированных или полученных путем биохимической очистки, значительно улучшило качество диагностики аллергии. Действительно, истинная сенсибилизация идентифицируется путем выявления IgE, специфичного для компонентов, ограниченных данным аллергеном. Перекрестная реакция определяется наличием иммунного ответа на перекрестно реагирующие компоненты, такие как профиллин и PR-10. Кроме того, молекулярная аллергодиагностика (MАД) позволяет выявлять специфические IgE для «потенциально опасных» компонентов (таких как LTP – переносчики липидов) или, по-видимому, безопасные (или минимально опасные) компоненты, такие как профиллин и полкальцины. Международные руководства по-прежнему указывают на то, что история болезни, физикальные данные и кожные прик-тесты (КПТ) – это первый эиап (первый уровень) диагностики аллергии (подход сверху вниз). Специфический IgE-анализ, проведенный на экстрагированных (цельных) аллергенах, считается диагностическим показателем второго уровня, а МАД считается диагностикой третьего уровня. Однако другие авторы предположили, что подход «снизу вверх» также может иметь преимущества. На основе этого широкий IgE профиль сенсибилизации, основанный на микрочиповой диагностике аллергенов (МДА), может быть чрезвычайно информативным. МДA была разработана в начале 2000 года, и в настоящее время ImmunoCAP ISAC (Thermo Fisher) на основе 112 различных молекулярных компонентов (как экстрагированных, так и рекомбинантных) является наиболее изученным и наиболее часто используемым молекулярным диагностическим инструментом на основе микрочипа. Недавно была разработана микросхема, объединяющая диагностику второго и третьего уровня Macro-ArrayDX (Wien, Австрия). Этот чип содержит 157 экстрактов аллергенов и 125 молекулярных компонентов и, по-видимому, содержит самый широкий в настоящее время набор аллергенов. Кроме того, основной анализ IgE на экстракты аллергенов в в одном и том же тесте способен оценить уровень IgE на соответствующие специфические и перекрестно-реактивные компоненты. Наконец, ингибирование реактивности CCD дополнительно улучшает специфичность IgE-анализа. В настоящем исследовании мы описываем, как этот расширенный профиль IgE можно рассматривать как перспективный инструмент для поддержки стратегий диагностики и лечения в современной ПМ у пациентов с аллергией.

Методы

ALEX был разработан компанией MacroArrayDX (Вена, Австрия).

Эта матрица содержит 282 аллергена (157 экстрактов аллергенов и 125 молекулярных компонентов). Большинство представлены аллергенами из группы ингаляционных, пищевых, латексных и инсектных аллергенов (таблица 1). Испытание является коммерчески доступным, получив сертификат СЕ, который, основываясь на Директиве Совета 93/42 / EEC относительно медицинских устройств [14], гарантирует, что качество анализа (то есть ограничение обнаружения, точность и повторяемость, отсутствие возможные нарушения, вызванные гемолизом и высоким уровнем триглицеридов, отсутствие влияния высоких уровней общего IgE, специфичность и линейность) соответствуют диагностическим признакам in vitro (IVD). Различные аллергены и компоненты замечены на нитроцеллюлозной мембране в картридже, который затем инкубируют с 0,5 мл разведения сыворотки 1:5 при перемешивании. Примечательно, что сывороточный разбавитель содержит ингибитор CCD. После инкубации в течение двух часов чипы интенсивно промывают и добавляют предварительно обработанное разбавление антитела против человеческого IgE, меченного щелочной фосфатазой, и инкубируют в течение 30 мин. После следующего цикла интенсивной промывки добавляют субстрат фермента и через несколько минут реакция завершается. Мембраны сушат, а интенсивность цветовой реакции для каждого пятна аллергена измеряется ПЗС-камерой. Специальное программное обеспечение оцифровывает изображения и готовит отчет, в котором перечислены аллергены и компоненты, и их оценка kUA/mL. Также измеряется общий IgE. Наконец, произвольная калибровочная кривая получается путем взаимодействия четырех пятен с уменьшающимися концентрациями специфического IgE, соответствующего <0.3 kUA/L, 0.3 — 1 kUA/L, 1 — 5 kUA/L, 5 — 15 kUA/L и> 15 kUA/mL.

Для оценки профиля IgE в сыворотках у пациентов с аллергией с помощью нового анализа было проанализировано 43 образца сыворотки. Размер выборки был рассчитан с учетом того, что в предварительных анализах 12% тестируемых аллергенов (включая результаты с низкой оценкой) были разными при анализе с помощью ALEX и при анализе другими методами (такими как специфический IgE для экстрактов или компонентов). Исходя из данных доказательств с уровнем достоверности 95% и стандартной ошибкой 0,05, рассчитанный размер выборки привел к 43 различным сывороткам. Из-за большого количества семейств аллергенов (круглогодичных или сезонных ингаляционных аллергенов, продуктов питания и т. Д.) и виртуальной невозможности изучения всех возможных семейств за одну работу были отобраны сыворотки с определенными характеристиками. Поэтому были использованы образцы пациентов с известной реакционной способностью к травам (где имелось наибольшее количество молекулярных компонентов) и перекрестно-реагирующие компоненты, в частности PR-10, профилин и LTPs [15]. В этом контексте считалось, что дополнительная ценность молекулярной диагностики может быть подробно описана. Все сыворотки ранее были протестированы с помощью ImmunoCAP ISAC. Поскольку ALEX является коммерчески доступным методом, пациенты (из частной медицинской практики одного из авторов) были предупреждены о том, что их сыворотка будет протестирована без затрат с помощью другого метода, который мог бы определить их профиль IgE исчерпывающим образом. Все пациенты приняли предложение в устной форме. Были оценены следующие параметры: а) корреляция между результатами экстрактов и результатами соответствующих компонентов в ALEX; б) корреляция между результатами ALEX и результатами ImmunoCAP ISAC; c) корреляция между суммой баллов ISAC и суммой баллов ALEX. Второй и третий параметры анализировали только для компонентов, представленных в обеих реагентах. Статистический анализ выполнялся с использованием статистических подпрограмм Microsoft Excel и PAST v3.16, свободного программного обеспечения для научного анализа.

Результаты

a) Анализ концентрации в экстрактах ALEX.

Этот анализ проводили с использованием сывороток пациентов, чтобы идентифицировать ситуации, в которых экстракты были положительными, но результат компонента был отрицательным. Хорошая концентрация была обнаружена для киви, ольхи, амброзии, сельдерея, арахиса, полыни, Aspergillus fumigatus, березы, собаки, орешника, Dermatophagoides pteronyssinus, D. farinae, кошки, трески, куриного яйца, яблока, постенницы, тимофеевки, персика и ясеня (Рисунок 1). Низкая консистенция наблюдалась у Hevea b., где экстракты были отрицательными, но Hev b 8 (profilin) ​​был положительным у некоторых пациентов.

b) Сравнение с результатами ImmunoCAP ISAC.

Для этой цели были сделаны два сравнения: во-первых, сравнение компонентов, присутствующих в обоих анализах (ISAC и ALEX), и представленных в подходящем количестве в когорте пациентов, оцененных, а во-вторых, сравнение способности идентифицировать такие же компоненты в пределах одного семейства. Показаны результаты однокомпонентных сравнений (рис.2). Очевидно, что коэффициенты корреляции были очень значительными для каждого сравнения. Действительно, для этого числа сравнений значение R> 0,39 соответствует вероятности 0,01% для «отсутствия корреляции», а наименьшее значение было 0,51 для Jug r 2, где использование ингибитора CCD в разбавителе образца модифицировали реакционную способность к хорошо известному высокогликозилированному компоненту. Аналогичный результат был достигнут путем сравнения результатов с помощью кривых ROC (не показаны). Очевидно, что результаты, приближенные к верхним левым углам, показали, что результаты обоих методов были очень сопоставимы.

c) Что касается способности ALEX идентифицировать компоненты семейства по сравнению с способностью ISAC, то был проведен статистический анализ, и результаты показаны в таблице 2. Очевидно, что может наблюдаться определенная гетерогенность, особенно в отношении частоты положительных результатов в анализируемом населении. Например, частота положительных результатов выше с использованием ISAC для LTP, PR-10, профилин и 2S-альбуминов, тогда как ALEX более часто положителен для тропомиозинов, 11S и 7S глобулинов. В последовательном порядке динамический диапазон ISAC в некоторой степени оказывается выше, чем у ALEX, по крайней мере для определенных семейств компонентов, таких как LTP.

d) Еще одно сравнение было сделано путем построения результатов компонентов, присутствующих как в ALEX, так и в ISAC у одного и того же пациента. На рисунке 3 показана оценка 12 пациентов, представляющих когорту. Значительная корреляция (r> 0,39, p> 0,01) наблюдалась у 10 из 12 пациентов. У одного пациента (идентифицированного K) коэффициент корреляции R составлял 0,38 (p <0,02), и только у одного пациента (L) можно было наблюдать любые связи. Однако у этих пациентов показатели были чрезвычайно низкими и ниже любого клинического или лабораторного значения.

e) Наконец, влияние ингибитора CCD было оценено в некоторых репрезентативных образцах. На рисунке 4 показаны необработанные данные ALEX на макроматрице. Очевидно, что обработка сывороток ингибитором CCD приводит к резкому снижению реакционной способности к экстрактам аллергенов, смесь аллергенов которых характеризуется высокой концентрацией углеводных цепей в структуре белка. Это открытие справедливо и для некоторых не рекомбинантных компонентов.

Рис. 1. Корреляция между суммой компонентов (горизонтальная ось) и результатами соответствующих экстрактов аллергенов (вертикальная ось), полученных ALEX

Рис. 2. Корреляция между результатами, полученными ALEX (горизонтальная ось) и результатами, полученными ISAC (вертикальная ось)

Рис. 3. Корреляция между результатами, полученными ALEX и ISAC на уровне пациента

Рис. 4. Влияние CCD ингибитора на двух образцах сыворотки, анализируемых ALEX с CCD ингибитором или без него. Очевидно, что после ингибирования реактивности CCD количество и интенсивность пятен на кристалле сильно уменьшались на панели B (только два пятна, исключая калибровочную кривую, оставались положительными). В панели А ситуация была немного противоположной, где число и интенсивность пятен были уменьшены, но большинство было положительным

Обсуждение

При отсутствии «золотого» стандарта для оценки эффективности анализа специфического IgE любая корреляция между различными методами должна быть тщательно оценена. Действительно, SPT не может использоваться для оценки результатов любого серологического анализа, поскольку он может быть положительным даже при отсутствии специфического IgE. Специфический IgE (анализируемый на целый экстракт) нельзя сравнивать напрямую с специфическим IgE, измеренный от молекулярных компонентов: действительно, положительный результат к целому экстракту редко соответствует положительным доступным компонентам. Наконец, сравнение анализов, в которых используются рекомбинантные молекулы, может иметь некоторые подводные камни. Действительно, клоны, используемые для получения реагентов разные, свертывание этих молекул может быть различным, иммуносорбент, используемый для прикрепления компонента к твердой фазе, может препятствовать доступности определенных эпитопов и, наконец, специфические молекулы IgE разных пациентов проявляют различные связывающие способности к различным эпитопам. Кроме того, каждый иммунологический анализ основан на конкретных концентрациях антигенов, тестовых сывороток, фермент-меченых антисывороток и ферментных субстратов, подходящих для обеспечения наилучшего динамического диапазона в используемых аналитических условиях. В диагностике аллергии в настоящее время используются различные платформы и субстраты, и в лабораторной медицине нормально наблюдать, что различные серологические анализы дают разные результаты, даже если корреляция часто наблюдается при определенных оперативных условиях. Кроме того, чем более сложным является анализ (или более сложный антиген или смесь антигенов), тем выше гетерогенность результатов. Имея в виду эти концепции, в настоящем исследовании мы проанализировали способность ALEX – нового инструмента, который можно было бы правильно использовать в стратегии снизу вверх по диагностике аллергии, для выявления сенсибилизации к аллергенам и компонентам. Для проверки характеристик ALEX считалось, что этот анализ был разработан на нитроцеллюлозе в качестве иммуносорбента, а лигирование аллергена на твердую фазу осуществляли наночастицей. Поэтому в рамках одного и того же анализа можно было бы точно выполнить сравнение результатов от всего экстракта и результатов соответствующих аллергенспецифических компонентов. Наблюдалась сильная связь между результатами целых экстрактов и результатами соответствующих компонентов. Это открытие особенно интересно, поскольку в прошлом эта строгая корреляция не была полностью соблюдена. Некоторые потенциальные объяснения этого результата включают: а) использование одного и того же иммуносорбента; б) выбор репрезентативных компонентов; и c) использование ингибитора CCD, который уменьшает неспецифическое распознавание IgE. Тот факт, что в одном анализе аллерголог может обнаруживать положительный результат в одном экстракте и получать информацию о соответствующих компонентах, является реальной добавленной стоимостью. Когда молекулярные компоненты на ALEX сравнивались с одними и теми же компонентами на ISAC, считалось, что твердые фазы различны, разведения в сыворотке были разными, второе антитело, вероятно, было разным, и ферментный субстрат также отличался. Кроме того, ALEX использует ингибитор CCD, а ISAC – нет. Тем не менее, лабораторные методы являются «искусственными» процедурами, которые пытаются имитировать in vitro то, что, как предполагается, происходит in vivo, и, что более важно, результаты тестов in vitro используются для поддержки диагностики и терапии аллерголога. Однако, несмотря на технические различия, удалось добиться значительной корреляции между методами. На уровне компонентов корреляция между результатами ALEX и данными ISAC была более чем положительной, по крайней мере, для профилей IgE, используемых в настоящем предварительном исследовании. Действительно, мы сосредоточились на образцах, характеризующихся сильной IgE-реакцией против пыльцы и связанных с ними перекрестно реагирующих аллергенов, потому что это область, в которой молекулярная диагностика, по-видимому, дает наиболее полезные результаты. Все корреляции были сильными, даже если ISAC показал более широкий динамический диапазон. Следует обсудить различия в динамическом диапазоне. Действительно, несмотря на десятилетия использования специфического IgE в клинике, прямая корреляция между конкретным уровнем IgE и тяжести заболевания наблюдалась для определенных пищевых аллергенов в одноплексных анализах. Однако для мультиплексных анализов эта корреляция никогда не описывалась, как правило для всех аллергенов и, по-видимому, не доказала свою ценность в клинике. Исходя из наблюдаемых результатов, нельзя сделать вывод, что различия в динамическом диапазоне существенно влияют на характеристики анализов. Способность обнаруживать сенсибилизацию к составным семействам характеризовалась определенной неоднородностью. Возможные объяснения заключаются в том, что на уровне компонентов в двух методах использовались разные молекулы, что приводило к различной способности сыворотки распознавать различные эпитопы. Кроме того, использование CCD-ингибитора в ALEX может вызвать дополнительные различия. Наконец, строгая корреляция между результатами молекулярных компонентов на одном уровне пациентов является окончательным доказательством того, что ALEX работает аналогично ISAC. Роль ингибитора CCD интересна [13]. Аллергологи обсуждают роль CCD в патологии человека. С аналитической точки зрения перекрестные реакции на CCD часто встречаются и могут повлиять на выбор компонента для АИТ. Таким образом, наличие ингибитора CCD позволяет получить положительный результат только тогда, когда распознавание аллергена (или компонента) специфично для самого белка.

Одной из основных дополнительных значений ALEX является его способность предоставлять результаты по целым экстрактам и соответствующим компонентам в рамках одного и того же анализа. Комбинация анализов второго и третьего уровней в одном и том же тесте позволяет определить одномоментно специфические IgE и является ли реакция истинной или перекрестной реактивной.

Учитывая общие социальные и личные издержки, наличие всех показателей в рамках одного анализа имеет неоспоримые преимущества. Это кажется особенно интересным, учитывая, что стоимость одного аллергена или компонента на чипе ALEX составляет приблизительно 0,30 €. Несмотря на то, что это может вызвать беспокойство у некоторых аллергологов, преимущество наличия широкого спектра аллергенов и компонентов также позволяет им разрабатывать рекомендации для пациентов с использованием стратегии снизу вверх: в этом контексте 282 аллергена в одном чипе облегчало оценку сенсибилизации, которая редко (или никогда) не тестировалась in vitro и / или in vivo в прошлом. Таким образом, эта функция позволяет аллергологу эффективнее определять профиль IgE пациента, а в некоторых случаях – улучшать идентификацию терапевтической стратегии, особенно в пищевой аллергии. В продолжение этого, следует учитывать, что выбор аллергенов и компонентов, разработанные производителями, является почти исчерпывающей. Однако, если какой-либо компонент, такой как омега-5-глиадин, Tri a 14 и альфа-Gal, добавить в анализ, диагностическая сила этого инструмента может быть дополнительно улучшена.

Вывод

В заключение, ALEX, иммуноанализ для определения уровня специфического IgE для целых экстрактов аллергенов и соответствующих молекулярных компонентов, представляет собой интересный новый подход к диагнозу аллергии снизу вверх. Сочетание экстрактов и компонентов должно сэкономить время и затраты, когда требуется точный диагноз аллергии, особенно с учетом АИТ для полисенсибилизированных пациентов и пациентов с пыльцевыми / пищевыми синдромами. Эти особенности, вместе с интересными результатами, наблюдаемыми в настоящем исследовании, показывают, что этот подход найдет интерес у аллергологов, особенно у аллергологов со знанием молекулярной аллергологии, в ближайшем будущем из-за его непосредственного влияния на стратегию ведения пациентов с аллергией в контексте персонализированного подхода.